Региональных стандартов технологий исследования функции органов и тканей - korshu.ru o_O
Главная
Поиск по ключевым словам:
Похожие работы
Название работы Кол-во страниц Размер
«Когда улыбка сияет здоровьем» 1 83.45kb.
- 14 1024.63kb.
У = ах2, у =, описание их свойств; решить приведенное квадратное... 1 400.68kb.
Самым распространенным внешним проявлением нарушений дыхания во сне... 1 40.24kb.
"Пищеварение в ротовой полости" 1 113.4kb.
Женское и мужское языковое поведение: проблемы и перспективы лингвистического... 1 62.46kb.
Руководство пользователя санкт-Петербург 2012г содержание краткое... 1 312.45kb.
Методический материал для педагогов дополнительного образования Применение... 1 42.59kb.
Руководство пользователя содержание 1 краткое описание 3 1 Основные... 3 429.14kb.
Филюшин Александр Владимирович Стратегия оптимизации взаимодействия... 2 339.81kb.
Комбинированные тесты в рамках стандартов второго поколения 1 247.99kb.
О влиянии никотина на стресс говорят уже давно. В основном, говорят... 1 41.68kb.
Инструкция по работе с сервисом «sms-платеж» 1 218.94kb.

Региональных стандартов технологий исследования функции органов и тканей - страница №12/13

2.4 Характеристика методики выполнения "Исследование антител к антигенам эритроцитов"

2.4.1 Требования к образцам крови.


Для исследования использовать сыворотку крови пациента. При использовании для исследования плазмы существует вероятность не выявления слабоактивных антиэритроцитарных антител за счёт разведения стабилизирующим раствором.

Перед процедурой забора крови на проведение исследования на антиэритроцитарные антитела у реципиента уточнить его фамилию, имя и отчество. Взять сухую чистую пробирку, на которую нанести следующую информацию о пациенте: Ф.И.О., дата забора крови, для стационарных больных - номер медицинской карты.

Кровь пациента забрать из вены в количестве 3-5 мл и перенести в подписанную пробирку. Использовать для исследования образец крови реципиента не более двухдневного срока хранения при t+20С…+80С. Взятый без консерванта.

Кровь, направляемая на исследование антител должна быть без признаков гемолиза, микробного роста, незамороженной. При наличии гемолиза процедуру взятия крови повторить.


2.4.2 Требования к помещению.


Иммуногематологические исследования проводить в помещении с естественным освещением, температура воздуха в помещении должна быть в пределах +150С …+250С.

2.4.3 Общие требования к проведению исследования на антиэритроцитарные антитела.


Прежде чем приступить к исследованию, необходимо произвести макроскопическую оценку реагентов, стандартных эритроцитов для скринингового исследования антител. Эритроциты не должны быть гемолизированы. Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть: при помутнении или появления хлопьев, при потере свойств застудневать при температуре +4…80С желатин не пригоден.

2.4.4 Требования к объемам исследований в зависимости от медицинского учреждения.

2.4.4.1 Стационар, в том числе дневной стационар в амбулаторно-поликлинических условиях.


При поступлении в стационар кровь пациента независимо от резус–принадлежности исследовать на наличие изоиммунных антиэритроцитарных антител перед плановой трансфузией переносчиков газов крови. Если реципиенту часто проводят гемотрансфузии, не нужно запрашивать образцы крови на исследование ежедневно, достаточно провести выявление антител каждые 72 часа.

В случае экстренной трансфузии исследование на антиэритроцитарные антитела проводить после проведения гемотрансфузии на образце крови, взятом до трансфузии.

При обнаружении в скрининговом исследовании антиэритроцитарных антител и, при необходимости гемотрансфузии переносчиков газов крови, кровь пациента направить в специализированную лабораторию службы крови для идентификации антител и, при необходимости, проведения индивидуального подбора.

При иммуногематологическом обследовании пациентов с гемотрансфузионными осложнениями по системам АВО, Резус и других клинически значимых антигенных систем провести исследование на наличие (отсутствие) антиэритроцитарных антител в учреждениях службы крови. Исследование крови назначить на 3-5-ые сутки после несовместимой гемотрансфузии, далее на 15-25-ые сутки и после 30-х суток.

При наличии гемолитической болезни новорожденных, связанных с конфликтом по системе АВО, провести исследование сыворотки родильницы на наличие иммунных групповых анти-А, анти-В антител, а также титр естественных групповых анти-А, анти-В антител.

При наличии гемолитической болезни новорожденных, аутоиммунной гемолитической анемии исследовать кровь пациентов прямой пробой Кумбса.


2.4.4.2 Женская консультация.


Исследование сыворотки крови на наличие антиэритроцитарных антител провести несколько раз в течение беременности независимо от резус–принадлежности в изосерологической лаборатории РКБ.

Беременным с группой крови О(I), А(II), В(III), имеющим супруга с иной группой крови, провести исследование уровня естественных антител (Ig M) и титра иммунных групповых анти-А, анти-В антител (Ig G).

Первое исследование провести при первичном обращении в женскую консультацию. Последующие исследования приведены на схеме 1.

В случае обнаружения в скрининговом исследовании антиэритроцитарных антител направить беременную на консультацию к врачу–изосерологу в Республиканскую клиническую больницу для составления индивидуальной программы ведения беременности.


2.4.5 Выявляемость. антиэритроцитарных антител к антигенам эритроцитов в различных методиках


При выборе методики для определения антител к антигенам эритроцитов следует помнить, что на выявляемость антител влияет титр антител в исследуемой сыворотке, их специфичность и форма антител (полные или неполные антитела). Сравнительная оценка методик определения антител представлена в таблице 7.
Таблица 7

Сравнительная оценка методик определения антител




Специфич-ность антител



Методы выявления

В солевой

среде


Экспресс – метод с 33% раствором

полиглюкина



Конглютинации

с 10% раствором

желатина


Непрямая

проба Кумбса (в т.ч. гелевый тест)



анти-А, анти-В

да

да/нет

да

нет

анти-DСЕ

маловероятно

да, если титр высокий, при низком титре - нет

да

да

Анти-Кell

маловероятно

да, если титр высокий, при низком титре - нет

да

да

анти-Fya, анти-Fyb

(Даффи)


нет

нет

нет

да

анти-Jka, анти-Jkb

(Кидд)


нет

нет

нет

да

анти-S

маловероятно

нет

нет

да

анти-Lea, анти-Leb

(Левис)


да

да

да

да

анти-Р1

да

маловероятно

да

маловероятно

анти-М, анти-N

да

маловероятно

да

маловероятно

Обозначения:

-да - антитела выявляются,

-нет – антитела не выявляются.

2.4.6 Порядок проведения исследования сыворотки реципиента на антиэритроцитарные антитела.

2.4.6.1 Исследование неполных антител к антигенам эритроцитов с применением 10% раствора желатина


Порядок проведения исследования:

1. В штатив установить 3 тонкостенные пробирки высотой не менее 10 см. Пробирки промаркировать, для чего указать Ф.И.О. реципиента, кровь которого исследуют.

2. В первые две пронумерованные пробирки внести по 1 капле (50 мкл) стандартных эритроцитов для скринингового исследования, в последнюю – одну каплю эритроцитов пациента.

3. Во все пробирки добавить по 2 капли (100 мкл) 10 % желатина, прогретого на водяной бане при температуре t+46-48 0С до разжижения.

4. Из пробирки с исследуемой кровью реципиента осторожно взять пипеткой сыворотку и внести по 2 капли (100 мкл) в первую и третью пробирки, во вторую 2 капли (100 мкл) сыворотки с низким титром антител для контроля.

5. Штатив с пробирками встряхнуть для перемешивания и поместить на водяную баню (t+46-48 0С) на 15 минут или в термостат (t+46-48 0С) на 45 минут.

6. После окончания инкубации пробирки извлечь, добавить 5-8 мл 0,9% раствора натрия хлорида, содержимое пробирок перемешать путём одно-двухкратного перевёртывания и оценить результат исследования.

Трактовка результатов:

Результат учитывать, просматривая пробирки на свет невооружённым глазом или через лупу в виде наличия или отсутствия агглютинации (см. рисунок 1).

Если в первой и второй пробирках наблюдается агглютинация в виде взвеси мелких или крупных красных комочков на фоне просветлённой или полностью обесцвеченной жидкости, а в третьей пробирке агглютинации нет (аутоконтроль отрицательный) значит, в исследуемой сыворотке обнаружены неполные антиэритроцитарные антитела.

Если в первой и третьей пробирках агглютинации нет, во второй – агглютинация, значит неполные антиэритроцитарные антитела не обнаружены. (см. рисунок 1). При отрицательном результате исследования необходимо сделать микропрепарат и микроскопировать его. Содержимое пробирок поместить на предметное стекло, покрыть покровным стеклом и просмотреть под малым увеличением.

При наличии агглютинации в третьей пробирке (аутоконтроль положительный) образец крови пациента направить в специализированное учреждение службы крови (СПК или ОПК) с соответствующим направлением (см. приложение 2) для дальнейшего исследования.



Агглютинации нет- Агглютинация есть-

антитела не обнаружены антитела обнаружены

Рисунок 1. Результаты исследования сыворотки на антитела

к антигенам эритроцитов.

2.4.6.2 Исследование антител к антигенам эритроцитов с использованием гелевых диагностических карт (непрямая проба Кумбса)


Исследование на изоиммунные антиэритроцитарные антитела проводить с применением диагностических карт Coombs, содержащих сыворотку Кумбса.

Порядок проведения исследования:

1. Перед исследованием проверить диагностические карты. Не использовать карты, если в геле имеются взвешенные пузырьки, микропробирка не содержит надосадочной жидкости, наблюдается уменьшение объёма геля или его растрескивание.

2. Микропробирки подписываются (фамилия реципиента).

3. Вскрыть необходимое количество микропробирок (по числу используемых стандартных эритроцитов для скрининга).

6. Автоматической пипеткой внести по 50 мкл стандартных эритроцитов для скринингового исследования.

7. Добавить во все микропробирки по 25 мкл сыворотки реципиента.

8. Инкубировать при t+370 С 15 минут.

9. После инкубации карточку центрифугировать в соответствующей центрифуге (время и скорость задаются автоматически).

Трактовка результатов:

Если осадок эритроцитов расположен на дне микропробирки (рисунок 2, №1) значит, в исследуемом образце сыворотки антиэритроцитарные антитела не обнаружены. Если агглютинаты задерживаются на поверхности геля или в его толще (рисунок 2, №№ 2-6) значит, в исследуемом образце обнаружены антиэритроцитарные антитела.
№1 №2 №3 №4 №5 №6

Рисунок 2. Результаты исследования при определении антител к антигенам эритроцитов гелевой методикой


2.4.6.3 Исследование титра естественных групповых анти-А, анти-В антител


Порядок проведения исследования:

1. Для определения титра естественных групповых анти-А, анти-В антител приготовить ряд разведений с раствором натрия хлорида 0,9% на плоскости. Если исследуют сыворотку О (I) группы сделать два ряда разведений, если A (II) или В (III) по одному ряду разведений.

2. На планшет нанести по одной большой капле (100 мкл) раствора натрия хлорида 0,9% в десять пронумерованных точек. Затем в первую точку добавить одну большую каплю (100 мкл) исследуемой сыворотки. Перемешать. Из первой точки с разведённой сывороткой перенести одну большую каплю (100 мкл) во вторую точку с раствором натрия хлорида 0,9%. Каплю перемешать, перенести одну большую каплю (100 мкл) разведения в третью точку и т.д. Из последней точки одну большую каплю (100 мкл) разведённой сыворотки удалить. Получается ряд разведений 1:2, 1:4, 1:8,1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 и т.д.

3. Рядом с каждой каплей разведённой сыворотки поместить по одной маленькой капле (10 мкл) стандартных эритроцитов АВО (соотношение сыворотки и эритроцитов 10:1). Для О (I) группы в первый ряд разведений - по капле эритроцитов А (II), во второй ряд разведений- по капле эритроцитов В (III). Для сыворотки А (II) - эритроциты В (III), для сыворотки В (III) - эритроциты А (II).

4. Капли перемешать стеклянной палочкой, начиная с наибольшего разведения.

5. Наблюдать за реакцией 5 минут при периодическом покачивании планшета.

Трактовка результатов:

За титр естественных групповых антител принимается наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила агглютинация (см. рисунок 3).



Рисунок 3. Определение титра естественных групповых анти-А, анти-В антител

2.4.6.4 Исследование титра иммунных групповых анти-А, анти-В антител в реакции солевой агглютинации


Порядок проведения исследования

А). Подготовительная работа:

1. Стандартные эритроциты А(II) и В(III) групп дважды отмыть раствором натрия хлорида 0,9%. Для чего в подписанные центрифужные пробирки внести стандартные эритроциты А(II) и В(III) соответственно. Добавить до 10 мл раствора натрия хлорида 0,9%. Пробирки центрифугировать при 1500-2000 об/мин в течение 5 минут. После чего осторожно слить надосадочную жидкость. На дне пробирки остаются эритроциты, из которых приготовить 2-3% взвесь эритроцитов в растворе натрия хлорида 0,9% (1 капля эритроцитов + 49 капель раствора натрия хлорида 0,9% или 50 мкл эритроцитов и 3 мл раствора натрия хлорида 0,9%).

2. Исследуемую сыворотку в количестве 1 мл развести в четыре раза раствором натрия хлорида 0,9% (3 мл) во избежание коагуляции при нагревании (получилось разведение сыворотки 1:4), затем пробирку прогреть 10 минут при t+700С.

Б). Техника определения:

1. Прогретую сыворотку раститровать на планшете с лунками: для сыворотки О(I) группы сделать два ряда разведений, для А(II) и В(III)- по одному ряду разведений. В десять точек нанести по 2 капли (100 мкл) раствора натрия хлорида 0,9%. Во вторую каплю добавить 2 капли (100 мкл) прогретой сыворотки. Раститровать. Получился ряд разведений 1:4, 1:8, 1:16, 1:16 и т.д.

2. Во все лунки добавить по одной капле подготовленной 2-3 % взвеси эритроцитов (при исследовании сыворотки А(II) группы добавить эритроциты В(III), при исследовании В(III) - эритроциты А(II), при исследовании О(I) - в первый ряд разведений- эритроциты А(II), во второй ряд разведений - эритроциты В(III)).

3. Осторожно перемешать.

4. Планшет поместить в термостат при t+37 0С на один час.

5. После окончания инкубации оценить результаты исследования.

Трактовка результатов:

Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне пробирки. При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков неравномерным слоем с изогнутыми краями. Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных иммунных антител, а последнее разведение, в котором оно наблюдается об их титре.

При отсутствии агглютинации осадок располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде правильно очерченного круга.

2.4.6.5 Исследование титра иммунных групповых анти-А, анти-В антител в реакции с применением 5% раствора унитиола


Для определения в исследуемой сыворотке групповых иммунных анти-А, анти-В антител используется готовая лекарственная форма 5% раствора унитиола.

Порядок проведения исследования

1. Для исследования взять две центрифужные пробирки (опыт и контроль). Промаркировать, для чего указать Ф.И.О. реципиента, пробирка №1 – опыт, пробирка №2 - контроль.

2. Из пробирки с исследуемой кровью пациента осторожно взять пипеткой сыворотку и внести 150 мкл на дно центрифужной пробирки (пробирка № 1). В пробирку № 2 внести 150 мкл моноклонального реагента анти-D Супер Ig M.

3. В обе пробирки добавить по 150 мкл 5% раствора унитиола (разведение 1:2).

4. Пробирки поместить в термостат при t+370С на два часа.

5. После инкубации исследуемую сыворотку раститровать на плоскости также как при определении титра естественных анти-А, анти-В антител (см. рис.3). Если исследуют сыворотку О(I) группы сделать два ряда разведений, если A(II) или В(III) по одному ряду разведений. Получаются следующие разведения: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 и т.д. Исследовать в реакции прямой агглютинации на плоскости с эритроцитами А(II) и /или В(III)

6. Добавить по одной маленькой капле (10 мкл) стандартных эритроцитов. При исследовании сыворотки А(II) группы добавить эритроциты В(III), при исследовании В(III) - эритроциты А(II), при исследовании О(I) - в первый ряд разведений - эритроциты А(II), во второй ряд разведений - эритроциты В(III).

7. Все капли перемешать стеклянной палочкой, начиная с наибольшего разведения. Наблюдать за реакцией 5 минут.

Содержимое контрольной пробирки исследуют также.

Трактовка результатов:

Контроль при определении иммунных групповых антител должен быть отрицательным (отсутствие агглютинации). Это говорит о разрушении полных антител (Ig М).

За титр иммунных групповых антител принимается наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила агглютинация.
2.4.6.6 Исследование на наличие фиксированных антиэритроцитарных антител (прямая проба Кумбса)

Порядок проведения исследования:

1. Исследуемые эритроциты отмыть четыре раза в стерильном растворе натрия хлорида 0,9%. Для этого в центрифужную пробирку поместить небольшое количество исследуемых эритроцитов (0,25-0,5 мл). Добавить до 10 мл раствора натрия хлорида 0,9%.

2. Центрифугировать при 1500-2000 об/мин. 3 минут.

3. Удалить надосадочную жидкость. Процедуру отмывания повторить трижды.

4. Из отмытых эритроцитов приготовить 5% взвесь отмытых эритроцитов. Для этого взять 1 каплю (50 мкл) отмытых эритроцитов и добавить 19 капель (1 мл) раствора натрия хлорида 0,9%.

5. 0,05 мл (1 капля) 5% взвеси исследуемых эритроцитов перенести на пластинку и покачивать в течение 3-х минут. Наступление агглютинации во взвеси эритроцитов до добавления сыворотки для пробы Кумбса свидетельствует об ауто- или панагглютинации исследуемой крови. В этом случае следует повторить все этапы постановки пробы, начиная с отмывания эритроцитов, но при температуре 37С0. Если агглютинация не наступила, к взвеси исследуемых эритроцитов добавить 0,05 мл (1 капля) сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешать сухой стеклянной палочкой. Наблюдать в течение 10 минут при периодическом покачивании пластинки.

Трактовка результатов:

При наличии на исследуемых эритроцитах фиксированных антиэритроцитарных антител – результат реакции будет положительным (наличие агглютинации). При отсутствии на исследуемых эритроцитах фиксированных антиэритроцитарных антител – результат реакции будет отрицательным (отсутствие агглютинации).

2.4.6.7 Исследование на наличие фиксированных антиэритроцитарных антител (прямая проба Кумбса в гелевом тесте)

Порядок проведения исследования:

1. Перед исследованием проверить диагностические карты. Не использовать карты, если в геле имеются взвешенные пузырьки, микропробирка не содержит надосадочной жидкости, наблюдается уменьшение объёма геля или его растрескивание.

2. Приготовить суспензию эритроцитов. Для этого 10 мкл исследуемых эритроцитов автоматической пипеткой поместить в центрифужную пробирку.

3. Добавить 1 мл разводящего раствора.

4. Микропробирку в диагностической карте Coombs подписать.

5. В микропробирку внести 50 мкл разведенных эритроцитов.

6. Карту центрифугировать в соответствующей центрифуге (время и скорость задаются автоматически).

Трактовка результатов:

Если антитела присутствуют на исследуемых эритроцитах, то агглютинаты будут задерживаться на поверхности геля или в его толще -результат положительный (см. рисунок 2 №№ 2-6). Если антитела отсутствуют на исследуемых эритроцитах, то эритроциты будут проходить через гель и осаждаться на дне микропробирки - результат отрицательный (см. рисунок 2 № 1).

Положительная реакция (наличие агглютинации) оценить в крестах от (+) до (++++) в зависимости от силы агглютинации (см. рисунок 2 №№ 2-6).

2.4.7 Регистрация результатов исследования


Результат исследования на антитела к антигенам эритроцитов вносится в бланк исследования (см. приложение № 2) и в «Журнал регистрации результатов определения групповой и резус принадлежности» (см. приложение 3).

При обнаружении антител к антигенам эритроцитов и при необходимости проведения трансфузионной терапии переносчиков газов крови, образец крови пациента направить в учреждение службы крови для проведения индивидуального подбора с соответствующим направлением (см. приложение № 4).

При выписке из стационара пациенту выдается справка о наличии у него антиэритроцитарных антител, которую необходимо предъявлять при каждой госпитализации.


<< предыдущая страница   следующая страница >>